详解：有关聚丙烯酰胺凝胶电泳凝胶的染色常识！ 很多业内人士非常熟悉聚丙烯酰胺凝胶，那您呢，现在和乐邦一起去了解它吧！在关于双向聚丙烯酰胺凝胶电泳的技术研究上有很多的研究成果，加深了人们对此的认识很多。在双向聚丙烯酰胺凝胶电泳上的平衡主要目的是进行蛋白质的烷基化以及使电泳介质达到与二向SDS-PAGE相同的缓冲体系。烷基化的目的是对蛋白质自由巯基进行修饰,使断开的二硫键不会再重新形成。平衡液使固相pH梯度胶条的pH适合第二向电泳,并防止电内渗,以提高蛋白质从一向到二向的转移效率。

    十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳　双向电泳的第二向是将IPG胶条中经过第一向分离的蛋白转移到第二向SDS-PAGE凝胶上,根据蛋白相对分子质量或分子量大小在与第一相垂直的方向进行分离。蛋白质与十二烷基硫酸钠(SDS)结合形成带负电荷的蛋白质-SDS复合物,由于SDS是一种强阴离子去垢剂,所带的负电荷远远超过蛋白质分子原有的电荷量,能消除不同分子之间原有的电荷差异,从而使得凝胶中电泳迁移率不再受蛋白质原有电荷的影响,而主要取决于蛋白质分子质量的大小,其迁移率与分子量的对数呈线性关系[5]。在蛋白质组研究中,需要在同样的条件下同时走多块胶,这对凝胶与凝胶之间的比较十分重要。

    2.3　凝胶的染色　

     凝胶染色的目的是使其中的蛋白质能够被观察到。目前还没有通用的染色方法,只能在考虑多种因素如灵敏度、线性范围、方便程度、费用,以及成像设备类型等基础上,结合实际情况进行选择。

2.3. 1　有机染料染色法　

考马斯亮蓝染色是经典的蛋白质染色方法,具有染色过程简单、所需配制试剂少、操作简便、无毒性、染色后的背景及对比度良好、与下游的蛋白质鉴定技术兼容性好等优点,其缺点在于灵敏度低,检测蛋白质的极限是8~10ng,对于低丰度蛋白难以显色,由于其价格低廉、重复性好,所以仍是实验室常用的染色方法[3],一般的检测分离都可以应用。近年来,在改进的方法中,通过应用胶体染色颗粒,胶本身不被显著着色,其原理是通过在染色过程中形成胶体颗粒和染料之间的平衡,染料进入胶内与蛋白点结合,胶体颗粒则被阻挡在胶外,胶本身不被染色[6],这与传统的考马斯亮蓝染色相比灵敏度要高接近一个数量级。除了考马斯亮蓝为基础的染料染色技术外,还有大量的其他蛋白质染色技术,但大多数具有特殊性能,这对其应用有所限制,只有少数一些直到现在还在应用。
    2.3. 2　金属离子还原法　

    金属离子还原法是较复杂的蛋白质检测方法之一[7]。其中最常用的是银染法,银染法比考马斯亮蓝染色灵敏度高,是通过将胶浸泡在含有银离子的溶液内,从胶面上洗掉非紧密结合的金属离子,加入某些试剂使与胶内蛋白结合的银离子形成金属银来显色。该方法可检测到纳克级的蛋白质。银染法主要分为硝酸银染色法和双胺银染色法,这两种方法的主要不同是固定剂和感光剂,这些不同直接影响检测结果的灵敏度和重现性。现在所用的方法比以前的改进了很多,自原始银染法于1979年发明以来,现在已经有超过100种衍生方法[8]。银染法可以说是目前灵敏度最高的检测方法之一,但是因为在银染时要加入醛类作为固定剂,这样虽然可以提高检测的灵敏度,但是对于后续的质谱分析却有较强的干扰作用。另外,由于碱性的和含硫氨基酸在染色中的特殊作用,不含或者只含很少胱氨酸残基的蛋白质又是呈负染,还有一些蛋白质难以染色。

    2.3.3　荧光染色法　

    荧光染料的灵敏度非常高,线性动态范围较好,但是它在实验室的普及性不如银染,主要原因是它所需要的仪器非常昂贵。荧光染色一般要在电泳之前通过共价作用在蛋白质的氮端引入荧光标记物。荧光染色对不同蛋白质之间的染色差异很小,并且对于质谱干扰小,不仅可以直接在凝胶上进行检测,也可以在膜上进行检测。这种方法不需要脱色步骤,就目前来说,荧光染色和质谱为基础的方法学为蛋白质组的多元定量分析提供了优越的技术支持。
    2.3. 4负染法　

    负染法与一般染色方法相反,其背景暗、样品亮。该法适宜对较小分散的样品染色。应用铜、锌等金属离子可以对蛋白质进行染色,方法与银染法类似,金属离子与蛋白质相结合才能被检测到,脱色过程非常简单,只要加入EDTA就可以很容易地脱色。这种方法的缺点是灵敏度不高,而且有重金属离子的污染。目前使用的负染方法有氯化钾、氯化铜、氯化锌、氯化镍、乙酸钴、锌-咪唑,常用的只有氯化钾、氯化铜和氯化锌三种,氯化锌是目前灵敏度最高的负染法[10]。

    2.3. 5　其他方法　

    放射自显影法是测定蛋白在某种变化中的放射性,这种方法灵敏度极高,可以用于蛋白质作用过程的动态研究,但是需要有特殊设备,成本昂贵,而且容易在测定过程中带来放射性污染。底物显色法主要用于一些水解酶类的鉴定,反应底物本身并不显色,但是和酶作用后,底物本身的显色基因可以留下来而显色。随着质谱鉴定灵敏度的不断提高,用于蛋白质组研究中的考马斯亮蓝染色法和银染法等传统检测方法的局限性逐渐暴露出来,新的染色方法及其衍生改进方法不断出现,如免疫印迹法等。新方法对两个方面作了改进:提高蛋白检测的灵敏度及增加与下游质谱鉴定的兼容性[11]。

    2.4　图谱分析

    2D-PAGE图谱斑点纷繁复杂,需要依靠计算机为基础的图像分析软件进行分析包括斑点检测、背景消减、斑点配比和数据库构建等在内的图象分析。对于绝大多数蛋白质组学实验室来说,图像分析是一个很重要的制约因素。目前应用较为广泛的图像分析软件有PDQuest、ImageMaster 2D Elite、Melanie、BioImage Investigator等,分辨率较高,功能齐全。尽管如此,仍不可避免有约10%的未检出点和假点,需要手工添加、删除和分割。

    3　2D-PAGE技术存在问题与发展

    2D-PAGE技术经过近些年的发展目前已经成为蛋白质组学研究的支撑技术,但还主要面临两个难题:一是各类极端蛋白质,如极酸、极碱、极低表达量蛋白等的分离还较为困难;二是2D-PAGE技术尚不完善、手工操作较多、经验性强、缺乏高通量的自动化系统。虽然2D-PAGE技术还存在一定的局限性,但其在分辨率及同时分离展现整个细胞、组织中的总蛋白等方面的特点,是多维液相色谱-质谱-质谱联用技术、毛细管等电聚焦技术、稳定同位素标记技术等其他蛋白质分析技术所不可比拟的。通过样品制备方法的改进以及精细pH范围及碱性pH范围的IPG胶条的应用,特别是以2D-PAGE技术为基础发展起来的差异凝胶电泳技术以及生物信息学的飞速发展,IPGs-2D-PAGE联合质谱鉴定技术,在高通量的蛋白质组分离与鉴定研究中,仍会处于核心地位。对于蛋白质组学研究来说, 2D-PAGE技术并不是蛋白质高通量分离的唯一选择,但仍然是目前分离蛋白质最有效的方法之一,是当前相对廉价高效的首要选择。2D-PAGE技术作为蛋白质组学的关键技术之一,近年来的发展非常迅速,在高通量分离和分析方面的进展,为蛋白质组学的研究奠定了有效的技术平台,蛋白质组分析的可靠和高效提供了重要保证。
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